病原微生物基因扩增检测(PCR)是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异性扩增上百万倍,从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力,能检测单分子DNA或每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品,因而此方法在分子生物学、微生物学、医学及遗传学等多领域广泛应用和迅速发展。
先将含有所需扩增分析的靶DNA双链经热变性处理解开为两条寡聚核苷酸单链,然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与靶DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片段,一般需20-30个碱基对,过少则难保持与DNA单链的结合。引物与互补DNA结合后,以靶DNA单链为模板,在Taq DNA聚合酶的作用下以4种脱氧核苷酸(dNTP)为原料按5'到3'方向将引物延伸、自动合成新的DNA链、使DNA重新复制成双链。然后又开始第二次循环扩增。
过去标准的PCR操作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中,然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。
1.向一微量离心管中依次加入DNA模板、引物、dNTP、10×PCR缓冲液、ddH2O,混匀后离心15s使反应成分集于管底。以上步骤仅在实验研究用,现在商品化试剂已将dNTP、10×PCR缓冲液,引物,ddH2O混合在一起,反应体积为20~25μL,只要试验人员加入处理好的含有靶DNA的模板就可以。
2.PCR的循环程序:根据实验室使用的试剂说明书进行设定。
PCR技术快速、简便、敏感性和特异性高,临床检测中应用广泛,不仅能满足病毒性疾病速诊断的需要,还有助于疾病预后的判断、疗效的监测等。
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